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瓊脂糖凝膠電泳的方法
更新時間:2019-06-18   點擊次數(shù):1968次
   瓊脂糖凝膠電泳的方法

  ① 凝膠類型

  用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。水平型電泳時,凝膠板*浸泡在電極緩沖液下1-2mm,故又稱為潛水式。目前更多用的是后者,因為它制膠和加樣比較方便,電泳槽簡單,易于制作,又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板,節(jié)約凝膠,因而較受歡迎。

 ?、?緩沖液系統(tǒng)

  缺少離子時,電流太小,DNA遷移慢;相反,高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產(chǎn)熱,嚴重時,會造成膠熔化和DNA的變性。

  常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TEA),Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等,濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液,臨用時稀釋到所需倍數(shù)。

  TAE緩沖能力較低,后兩者有足夠高的緩沖能力,因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀,為避免此缺點,室溫下貯存5×溶液,用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。

 ?、?凝膠的制備

  以稀釋的電極緩沖液為溶劑,用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠,灌入水平膠框或垂直膠膜,插入梳子,自然冷卻。

 ?、?樣品配制與加樣

  DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解,緩沖液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料,含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油,以增加其比重,使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結果產(chǎn)生U形條帶,可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。

 ?、?電泳

  瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明,在低濃度、低電壓下,分離效果較好。在低電壓條件下,線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是,在電場強度增加時,較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高,電泳分辨率反而下降,為了獲得電泳分離DNA片段的大分辨率,電場強度不宜高于5V/cm。

  電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳,只有當凝膠濃度低于0.5%時,為增加凝膠硬度,可在4℃進行電泳。

 ?、?染色和拍照

  常用熒光染料溴乙錠(EB)染色,在紫外光下觀察DNA條帶,用紫外分析儀拍照,或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片,并進行有關的數(shù)據(jù)分析

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