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抗酒石酸酸性磷酸酶染液說明書
更新時(shí)間:2016-06-22   點(diǎn)擊次數(shù):2774次

抗酒石酸酸性磷酸酶染液說明書

tartrate-resistant acid phosphate stain, TRAP stain

產(chǎn)品用途:

存在于正常人肺泡巨噬細(xì)胞等部位的TRAP和存在于細(xì)胞白血病人脾臟的TRAP均在細(xì)胞濾泡中,并不釋放入血液,血液中TRAP絕大部分來源于破骨細(xì)胞。因而測(cè)量血液中TRAP可以了解破骨細(xì)胞的功能狀態(tài)。本染液可用于石蠟切片、血液及骨髓涂片、細(xì)胞爬片、冰凍切片中的破骨細(xì)胞染色。

 

檢驗(yàn)原理:

在酸性的緩沖液中,細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶催化底物水解,其生成物進(jìn)而與一種穩(wěn)定的重氮鹽偶聯(lián),生成不溶性的偶氮染料沉淀,當(dāng)?shù)孜镏写嬖诰剖釙r(shí),該反應(yīng)只出現(xiàn)在特異性細(xì)胞中。

 

儲(chǔ)存條件及有效期:

本試劑盒室溫密封保存,有效期3個(gè)月。所有應(yīng)用液配置后要立即使用,當(dāng)天一次用完。

所需儀器:

光學(xué)顯微鏡、染缸、玻片、滴管、秒表、記號(hào)筆等。

試劑組成及配制:

簡明試劑組成表

試劑組成

試劑編號(hào)

包裝規(guī)格

一、固定液

 

40ml×1瓶

二、底物液

底物反應(yīng)液(一)

甲液

  • A粉×1支
  • B液500ul×1支

乙液

  • C粉×1支
  • D液,500ul×1支

底物反應(yīng)液(二)

  • E粉×1支
  • F液,500ul×1支

底物反應(yīng)液(三)

G液,1ml×1支

底物反應(yīng)液(四)

  • H粉×1支
  • I液,500ul×1支

三、復(fù)染液

蘇木素

10ml×1瓶

甲基綠

10ml×1瓶

 

具體試劑配制及操作:

一、固定液:液體,40ml×1瓶

新鮮血涂片、細(xì)胞涂片或爬片、冰凍切片用固定液固定5~10min。石蠟包埋的切片經(jīng)脫臘后不需要再固定。

二、底物反應(yīng)液()()、()()的組成及配制:

●底物反應(yīng)液()組成及配制

組成:(1)A粉×1    (2)B500ul×1

(3)C粉×1    (4)D500ul×1

配制:臨用前將B液用移液器吸入A粉中充分溶解配成甲液,備用

再將D液移液器吸入C粉中充分溶解配成乙液,備用

zui后將甲液與乙液混合成底物反應(yīng)(),備用

●底物反應(yīng)液()組成及配制:

組成:(1)E粉×1    (2)F500ul×1

配制:臨用前將底物反應(yīng)液二的F液移液器吸入E粉中充分溶解配成底物反應(yīng)液(),備用。

●底物反應(yīng)液()G1ml×1支,備用

●底物反應(yīng)液()組成及配制:

組成:(1)H粉×1    (2)I500u l×1

配制:臨用前將I液移液器吸入H粉中充分溶解配成底物反應(yīng)液四,備用

底物孵育液的配制:

染色缸染色孵育法:

①將底物反應(yīng)液()、()、()、()的備用液混合并充分混勻,

②先在染缸內(nèi)加30 ml蒸餾水,37℃水浴10分鐘,

③將底物反應(yīng)液()()、()、()依次加入已預(yù)溫的蒸餾水中,

④然后將樣本玻片固定,水洗后還末*干前,,立即將樣本玻片放入已準(zhǔn)備好的反應(yīng)孵育液中,避光孵育60分鐘。

三:復(fù)染液:蘇木素液,10ml×1

甲基綠液,10ml×1

孵育完后,取出水洗1分鐘,在玻片尚未*干之前進(jìn)行復(fù)染。

可用蘇木素復(fù)染1-2分鐘,或用甲基綠復(fù)染23分鐘,兩者取其一

樣本染色前處理及染色:

血涂片及骨髓涂片

1、推片:取全血或骨髓3微升左右置載玻片上,將推玻片保持與載玻片30度角,置于血滴正前方,稍往后移與血滴接觸,血滴沿推片下緣散開,再勻速沿載玻片平面平穩(wěn)向前滑動(dòng),至血液鋪完血膜為止。滿意效果為不太薄,以免細(xì)胞太少,也不要太厚,以免太重疊。

2、涼干:使涂片在空氣中自然涼干,再放入本試劑盒中的固定液內(nèi)固定2~3分鐘,水洗約30~60秒。

3、一定注意水洗后不要太干時(shí)放入底物液中孵育60分鐘(太干后染色效果欠佳)。

石蠟切片

1、二甲苯中脫蠟5~10分鐘。再換用新鮮的二甲苯,脫蠟5-10分鐘。

2、無水乙醇5分鐘。再90%70%乙醇各2分鐘。

3、水合:蒸餾水2分鐘。

冰凍切片

1、回溫:將預(yù)先制好的并保存在-20℃冰箱中的冰凍切片放置到切片架上回溫【注】 5-10分鐘。

【注】:1)可放到37℃孵箱中進(jìn)行回溫;

       2)在37℃水浴箱中放置一個(gè)小盒子,再將從冰箱中取出的切片架放到小盒當(dāng)中,目的是讓冰凍切片回溫到37℃。

2、水合:將回溫好的切片,水中浸泡1~2分鐘。

注意事項(xiàng):

1、如樣本為骨片的石蠟切片,要注意不可用硝酸脫鈣,酸脫鈣的方法對(duì)蛋白質(zhì)(酶類)傷害較大,從面影響特異性酶染色,會(huì)使細(xì)胞中的特異性酶失活,導(dǎo)致酶不能跟底物結(jié)合,從而導(dǎo)致染色失敗。建議使用抗酒石酸酸性磷酸酶的試劑進(jìn)行脫鈣,本公司有售,咨詢。

2、用底物孵育液進(jìn)行孵育時(shí)要注意避光。

染色結(jié)果:

陽性反應(yīng)為鮮紅色或深紅色顆粒,定位胞漿。

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